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细胞融合仪过程技术分析

发布时间::2018-04-12    浏览次数:60

细胞融合过程技术分析


融合的方法很多,常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1zui为常用。


1.试剂与材料


(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。


(2)1640培养液100ml。


(3)完全1640液100ml。


(4)2.5%FCS-1640液50ml。


(5)HAT培养液100ml。


(6)50%PEG:取分子量4000,高纯度的(日本进口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌,使用前用预热于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚红检查pH,一般不必调pH。如pH有改变,可用HCl或NaHCO3调整。


(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。


(8)40孔塑料培养盘。


2.细胞融合仪操作方法


⑴准备好脾细胞。


⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞,并加入50ml2.5%FCS-1640液。


⑶室温400g离心3min,使细胞沉淀。


⑷移去上清液。


⑸轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于40℃水浴中,使其达融合温度。


⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml,用1ml吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续2min。


⑺加1ml1640液,边加边摇动,持续1min。


⑻重复⑺一次。


⑼加1ml1640液,边加边摇动,持续0.5min。


⑽重复⑼一次。


⑾加1640液15ml。


⑿室温,400g离心1min,细胞融合仪使细胞沉淀。


⒀去上清,轻敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。


⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔1滴(约0.05ml)。


⒂轻摇后,放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。


⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液,勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要加入适量的饲养细胞。


⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察,大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现,但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。


⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中,依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同时保存于液氮和进行克隆化,在这期间每代都要检查抗体,以防止产生抗体细胞的变异和丢失。


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